O laboratório poderia influenciar as aneuploidias pré implementação?

Variações nas técnicas e protocolos entre os centros de fertilização in vitro são bem reconhecidas e podem levar a diferenças nos resultados bem-sucedidos. Essas disparidades podem resultar da população de pacientes ou das abordagens clínicas usadas para tratar a infertilidade. No entanto, as diferenças nos resultados da fertilização in vitro entre os centros também podem ser atribuídas às condições dentro do laboratório de embriologia e à qualidade do embrião resultante. Estudos usando doadores de óvulos como população de controle mostraram que as taxas de euploidia embrionária podem diferir em até 40% entre os centros de fertilização in vitro (Munne et al., 2017). A origem dessas diferenças, se meiótica ou mitótica, é desconhecida. Se meiótica, todas as células do embrião resultante são afetadas, sugerindo um foco nas práticas clínicas e protocolos de estimulação que afetam o oócito. Se mitótico, o foco muda para o laboratório de fertilização in vitro e as condições de cultura durante o desenvolvimento do embrião. Os embriões resultantes podem não ser totalmente aneuploides, e o mosaicismo indicaria uma possível origem mitótica. Comentários anteriores discutiram a ligação potencial entre as condições de cultura de laboratório de fertilização in vitro e o mosaicismo de embriões (Munne e Alikani, 2011), embora os dados fossem esparsos e derivados de sistemas de cultura inicial, embriões em estágio de clivagem e análise de hibridização in-situ de fluorescência (FISH) (Munne et al., 1997), com limitações inerentes. Felizmente, novas plataformas de análise genética agora têm a sensibilidade para detectar de forma mais confiável o mosaicismo de amostras de blastocisto biopsiadas. Estudos preliminares indicam que as taxas de mosaicismo embrionário diferem entre os centros de fertilização in vitro, com alguns relatando diferenças de até 10% (Sachdev et al., 2016; Wells et al., 2016). Isso sugere diferenças significativas entre os centros e implica que as condições dentro dos laboratórios modernos de fertilização in vitro podem influenciar os erros de divisão mitótica durante a cultura de embriões estendida.

As práticas e técnicas de laboratório também podem afetar os resultados dos testes cromossômicos. Fatores como técnica de biópsia e manuseio celular podem afetar a integridade do DNA. Variações nos métodos usados para obter células trofectodermas, o número de células retiradas, a localização das células retiradas, o rigor da lavagem das células antes do carregamento, o tempo ou a temperatura de retenção das células entre a biópsia e o carregamento celular e as condições de envio das células podem afetar potencialmente a qualidade do DNA e a fidelidade dos resultados do teste genético pré-implantação para aneuploidias (PGT-A). Além disso, plataformas analíticas aprimoradas e maior sensibilidade significam que a transferência e a contaminação do DNA durante o processamento de células também devem ser consideradas. Quantidades mínimas de DNA extrudado por embriões em meios de cultura podem ser usadas para avaliar o complemento cromossômico (Kuznyetsov et al., 2018; Liu et al., 2017; Vera-Rodriguez et al., 2018). Assim, fatores como o enxágue completo dos embriões antes da biópsia ou a quantidade de transferência de meio ao mover os embriões, especialmente se cultivados em grupos, podem afetar os resultados genéticos. A transferência de meio ao usar a mesma pipeta de biópsia ou pipeta de carregamento entre embriões também pode ter considerações importantes. Portanto, o processo de obtenção de células para análise pode ser uma causa tão provável para as diferenças observadas entre os laboratórios quanto as condições usadas para o crescimento dos embriões. A influência do laboratório de genética também não deve ser negligenciada (Laoannou et al., 2018). Diferentes laboratórios de genética usam vários métodos para carregamento e análise de células, com alguns empregando métodos mais manuais e outros usando mais automação. Diferentes plataformas e limiares são usados para diagnosticar normal versus anormal versus mosaico. Algumas interpretações de resultados são realizadas manualmente, enquanto outras são automatizadas. O surgimento da inteligência artificial para interpretar resultados genéticos também está em uso. Além disso, alguns laboratórios que usam inseminação padrão podem sofrer contaminação sutil devido à remoção insuficiente de células do cumulus ou excesso de espermatozóides ligados, o que pode interferir nos resultados do PGT-A e influenciar as leituras de mosaicismo. Um estudo recente sugere que a inseminação padrão pode aumentar as células do mosaico em 5% em comparação com a ICSI (Palmerola et al., 2019). No entanto, esses achados podem ser contestados se o laboratório garantir a lavagem adequada dos óvulos/embriões antes da biópsia, considerando o empacotamento exclusivo do DNA do esperma. O número de variáveis envolvidas no fornecimento de uma amostra de alta qualidade para análise cromossômica é imenso.

Curiosamente, em uma grande rede de laboratórios de fertilização in vitro usando o mesmo sistema de cultura e protocolos – incluindo o mesmo meio, proteína, óleo, material plástico, pH, incubadoras, oxigênio, treinamento de biópsia, sistemas de gerenciamento de qualidade e outros itens relevantes – juntamente com o mesmo laboratório de genética, não foram observadas diferenças nas taxas de mosaicismo entre as instalações (mosaicismo total de <3% por local com variação de <1% entre seis locais) (Katz-Jaffe et al.,  2017). Isso sugere que, embora a população de pacientes e os protocolos de estimulação sejam importantes, o rigoroso controle de qualidade laboratorial pode minimizar a variabilidade na aneuploidia/mosaicismo entre as instalações de fertilização in vitro.

É importante notar que, embora cenários plausíveis de causa e efeito possam ser propostos para como as variáveis dentro do sistema de cultura de embriões podem afetar a mitose embrionária, faltam evidências concretas. Dados preliminares sugerem que as variáveis de cultura controladas em laboratório de fertilização in vitro podem influenciar os erros mitóticos do embrião pré-implantação. Fatores como pH, osmolalidade e temperatura podem desempenhar um papel na fidelidade das divisões mitóticas e, se não forem bem controlados, o estresse sutil de cada uma pode afetar cumulativamente a separação/segregação cromossômica. Portanto, os fatores dentro do sistema de cultura que controlam o desenvolvimento embrionário devem ser considerados, e a pesquisa continuada deve se concentrar em fatores dentro do laboratório de fertilização in vitro que podem levar ao estresse celular e possíveis erros mitóticos. No entanto, o impacto das técnicas laboratoriais (abordagem de inseminação, técnica de biópsia e outros potenciais estressores de manuseio), bem como a influência do laboratório de genética de referência, não devem ser negligenciados.

 

Referências:

Katz-Jaffe, M., McReynolds, S., de Klerk, K., Henry, L., Schweitz, M., Swain, J., Schoolcraft, W. Extremely low incidence of mosaicism in human blastocysts mimics occurrence in natural an ivf clinical pregnancies. Fertil. Steril. 2017; 108: e87–e88

Kuznyetsov, V., Madjunkova, S., Antes, R., Abramov, R., Motamedi, G., Ibarrientos, Z., Librach, C. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One 2018; 13e0197262

Laoannou, D., Baker, M., Jones, S., Grass, L., Miller, K. A comparison of diagnostic results of preimplanation genetic testing for aneuploidy (PGTA) from reference laboratories during a period of transition; trends and inherences for patient care. Fertil. Steril. 2018; 110: e34

Liu, W., Liu, J., Du, H., Ling, J., Sun, X., Chen, D. Non-invasive pre-implantation aneuploidy screening and diagnosis of beta thalassemia IVSII654 mutation using spent embryo culture medium. Ann. Med. 2017; 49: 319–328

Munne, S., Alikani, M. Culture-induced chromosome abnormalities: the canary in the mine. Reprod. Biomed. Online 2011; 22: 506–508

Munne, S., Alikani, M., Ribustello, L., Colls, P., Martinez-Ortiz, P. A., McCulloh, D. H., Referring Physician, G. Euploidy rates in donor egg cycles significantly differ between fertility centers. Hum. Reprod. 2017; 32: 743–749

Munne, S., Magli, C., Adler, A., Wright, G., de Boer, K., Mortimer, D., Tucker, M., Cohen, J., Gianaroli, L. Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos. Hum. Reprod. 1997; 12: 780–784

Palmerola, K. L., Vitez, S. F., Amrane, S., Fischer, C. P., Forman, E. J. Minimizing mosaicism: assessing the impact of fertilization method on rate of mosaicism after next-generation sequencing (NGS) preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A). J. Assist. Reprod. Genet. 2019; 36: 153–157

Sachdev, N., Ribustello, L., Liu, E., McCulloh, D., Grifo, J., Munne, S. The rate of mosaic embryos embryos from donor egg as detected by next generation sequencing (NGS) varies by IVF laboratory. Fertil. Steril. 2016; 106: e156

Vera-Rodriguez, M., Diez-Juan, A., Jimenez-Almazan, J., Martinez, S., Navarro, R., Peinado, V., Mercader, A., Meseguer, M., Blesa, D., Moreno, I., Valbuena, D., Rubio, C., Simon, C. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Hum. Reprod. 2018; 33: 745–756

Wells, D., Alfarawati, S., Taylor, S. A., Kubikova, N., Spath, K., Turner, K., Hickman, C., Fragouli, E. Evidence that differences between embryology laboratories can influence the rate of mitotic erros, leading to increased chromosomal moscaicism, with significant implications for IVF success rates. Hum. Reprod. 2016; 31: i25

 

Bruno Coprerski